PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/05/15 07:41:24
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对
为什么只有10个碱基配对呢?引物总长多少?
如果目的片段构建克隆了,用质粒试试。
如果引物3撇末端与模板是正确配对的,可以降低退火试试。
楼主的实验背景是怎样的?引物5撇端有修饰吗?退火温度应该没有问题,是按照引物合成说明书上的Tm值减去5度。 5端还有酶切位点和3个保护碱基。 实验是为了将质粒中的基因克隆出来。降低退火后 引物更容易与模板结合 当引物与模板不完全配对时会提高扩增效率 但是会降低引物的特异性,很容易出现...
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如果目的片段构建克隆了,用质粒试试。
如果引物3撇末端与模板是正确配对的,可以降低退火试试。
楼主的实验背景是怎样的?引物5撇端有修饰吗?
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引物是短了,一般要20bp,最少也要18bp,再加上酶切位点和保护碱基。
一般配对碱基数都要在15个或以上
还有就是引物单上的退火温度是根据19bp全配对计算的,你忽略了9bp未配对。真正的应该是就算你那10个配对的碱基产生的Tm
引物短了点,一般18-25bp,上30bp都可以。primer 5软件设计的时候,软件是设计的10bp的?不是吧?
另外,是不是看看解链温度,PCR仪导热不太好,DNA双链有可能没解开,这个是许许多多PCR失败的关键原因。不是PCR仪的问题,因为实验室大家都在用。那你重新设计下引物吧。应该是用的primer5 辅助设计的吧,我觉得这是个很好的软件...
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引物短了点,一般18-25bp,上30bp都可以。primer 5软件设计的时候,软件是设计的10bp的?不是吧?
另外,是不是看看解链温度,PCR仪导热不太好,DNA双链有可能没解开,这个是许许多多PCR失败的关键原因。
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