作业帮连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?我手头上有六段DNA片段（假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/04 01:16:00
连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?我手头上有六段DNA片段（假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与
连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?
我手头上有六段DNA片段（假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与F的粘末端可以互补匹配,并且是唯一的匹配（举例：A的粘末端仅与B的匹配,而不能与C,D,E,F的匹配,等等）.我的想法是用T4连接酶一次性把这6段DNA片段连接成约200bp左右的长片段,然后在长片段两端设计两个PCR引物进行扩增.然后将PCR片段割胶回收,然后双酶切,最后连接到经过了同样双酶切的质粒中.请问这样的思路是否可行,其中有什么地方要注意?还有就是上面的连接反应产物是否可以直接用来做PCR?,要不要先灭活其中的T4连接酶?
连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?我手头上有六段DNA片段（假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与
这样做实际上是不可行的,效率会很低.我以前也想你一样试过.
原因：粘性末端相连的机会不大,而且要6个同时都相连,机会是呈指数级别下降的.而且如果直接做PCR的话,那些没有连接或者部分连接的片段十个极大的干扰.
2个方案：既然酶切位点独特,建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端,连接后直接克隆.比做PCR的可能性要大.
或者先做AB, CD, EF连接,克隆后再做两次ABCD+EF连接.
博凌科为-为你理论上讲，你可以这样做，甚至可以直接做PCR而不用连接。这个其实和多对分段克隆基因的原理一样，都是让前一对引物的下游引物，和后一对引物的上游引物有一段互补序列。这样所获得的PCR片段就是前一段的末端和后一段的前端就会有互补序列。但是问题是，这样的前后序列一般有15个碱基左右的互补序列，而酶切位点的互补序列太短。这个需要你把PCR反应的退火温度降低。来保证碱基互补。...
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博凌科为-为你理论上讲，你可以这样做，甚至可以直接做PCR而不用连接。这个其实和多对分段克隆基因的原理一样，都是让前一对引物的下游引物，和后一对引物的上游引物有一段互补序列。这样所获得的PCR片段就是前一段的末端和后一段的前端就会有互补序列。但是问题是，这样的前后序列一般有15个碱基左右的互补序列，而酶切位点的互补序列太短。这个需要你把PCR反应的退火温度降低。来保证碱基互补。
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连接产物可以用来直接作为PCR的模板，我做过。不放心的话可以65度20分钟处理一下。
我觉得这样做是可行的。但是最终的PCR产物可能会有各种非特异性扩增，切胶回收时要注意片段大小是否正确
你这个想法理论上讲是可行的，但是实际操作起来就会存在很大的困难。小片段连接比较难做。根据你的叙述，最后连接好的片段约为200bp左右。我建议你把这200bp的片段分成4段，即1，2，3，4段，合成有15个碱基互补的4条引物，1与2，3与4做一次重叠延伸，然后以1与2，3与4的产物为模板，1和4为引物在做一次重叠延伸PCR，这样就ok了，速度会很快的。分成4段是因为引物合成碱基个数小于60个的，按正...
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你这个想法理论上讲是可行的，但是实际操作起来就会存在很大的困难。小片段连接比较难做。根据你的叙述，最后连接好的片段约为200bp左右。我建议你把这200bp的片段分成4段，即1，2，3，4段，合成有15个碱基互补的4条引物，1与2，3与4做一次重叠延伸，然后以1与2，3与4的产物为模板，1和4为引物在做一次重叠延伸PCR，这样就ok了，速度会很快的。分成4段是因为引物合成碱基个数小于60个的，按正常收费，这样节约成本。
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